AM-AM-FS-Ac-02006 香兰豆萃取液中的香兰素、乙基香兰素和香豆素

AMAMFSAc02006  香兰豆  萃取液  香兰素  乙基香兰素  香豆素  色谱分离-分光光度法

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香兰豆萃取液中的香兰素、乙基香兰素和香豆素

1.仪器和试剂

1.1 仪器

(a) 分光光度计——可测范围270 nm和325 nm，所用狭缝宽小于10 nm以调节为高灵敏度。

(b) 石英样品池——1cm，与270 nm和325 nm处测定吸光度相匹配。用异辛烷-三氯甲烷作溶剂，异辛烷（此溶剂能测出其他介质所不能检出的差别）。在加入异辛烷-三氯甲烷溶剂、标准溶液和样品溶液之前，样品池中必须不含其他溶剂。两次测定之间，应将小池倒置在毛巾上，使池内液体流净。测定时，注入溶液使弯液面比光路高出3 mm以上。

(c) 色谱柱——14 mm (外径) × 450 mm (长) 。

1.2 试剂

    (必须使用同一批号的黑辛烷以制备溶剂混合液和所有用于各组测定的稀释剂)

    (a) 硅酸 — 试剂级，100目粉末，适用于色谱分析。按下法测定二氧化硅含量:准确称取硅酸约1g于已称重的铂坩埚中。在615℃ 马福炉中灼烧I5 min，放入干燥器中冷却，再称重。计算硅酸中的S0₂% (z) 。计算5.8g色谱柱所需的硅酸 ( x ) :

     x = 3. 384 ×100 / z ，色谱柱所需的水的体积，mL ( y ) = 5. 80 － x 。

     (b) 异辛烷 — 实验级，为2，2，4-三甲基戊烷，99. 5十 %，沸点98—100 ℃ 。

     (C) 异辛烷-三氯甲烷溶剂混合液 — 加三氯甲烷40 mL至异辛烷1L中，混合后贮于不透气的瓶中 (勿使用橡胶塞)。该溶液含CHCl₃约3.85% 。

     (d) 香豆素标准溶液—1mg / mL 。准确称取香豆素100mg，置于100mL容量瓶中，用50mL三氯甲烷熔解，并用异辛烷稀释至刻度。

     (e) 乙基香兰素标准溶液 — 用乙基香兰素按 (d) 法制备。

     (f) 香兰素标准溶液 — 用香兰素按 (d) 法制备。

2.试验过程

2.1吸光度的测定

     移取香兰素标准溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加CHCl₃ 3.4mL，用异辛烷稀释至刻度，混合。测定在270 nm和325 nm波长处的吸光度A，用 (c) 项溶剂作参比，置溶液于lcm石英样品池中。计算香兰素在270 nm和在325 nm波长处的a (g / L; 1cm池) :a = l00A。

    乙基香兰素和香兰素的a按相似的方法测定。

2.2色谱柱的制备

    将小块棉絮填入干燥的色谱管底部。在研钵中放硅酸x克，从滴定管加水y毫升，充分混合，用研杵快速研磨使成均匀的粉状粘稠物，立即加溶剂 (c) 25mL。混和并快速通过漏斗将粉浆倾入管中。用小量溶剂冲洗钵和漏斗。用长而细的玻璃棒搅拌，排去产生的气泡。用约13.8 kPa的空气压力填紧层析柱，直至溶剂的弯液面恰好触及硅酸的顶面而弯液面却仍清晰可见。立即释放压力 (注意:如色谱柱中有空沟或开裂，则弃去。在填充时和填充后，都要使柱保持垂直。倾斜会使柱毁坏，虽然看上去正常但不能再用。)小心地用玻璃棒引导将15 mL溶液沿色谱管壁缓缓流入管内，务必使柱内填料不受搅动。通过色谱柱驱出溶剂。洗过的柱就可以作校准用了。

2.3色谱柱的校准

    吸取 (d)、(e) 和 (f ) 标准液各1mL，放入25mL容量瓶。用异辛烷稀释至刻度，混合。移取该溶液2mL，沿色谱柱一侧放入柱顶。用约13.8 kPa的空气压力将溶液驱入柱内，在10mL量筒中收集洗脱液。当弯液面触及填料顶部时，立即释放压力，弯液面外部应仍清晰可见。移取 (c) 液剂1mL，沿着管的同一侧放入柱上，并驱入柱内。用2份1mL溶剂重复此项操作。注入溶剂到顶部2cm以内。以5mL / (2—2.5) min之流率驱使溶剂流过色谱柱，收集洗脱液5mL的流份，在收集过程，交替使用2个 l0 mL量筒。将流份分别倾入架上的试管中，流份进行连续编号。量筒在使用之前，应先将其倒置于毛巾上排净原溶液。收集10个流分，用l cm石英样品池，以溶剂 (c) 为 (空白参比溶液)，在270 nm和325 nm波长处测定吸光A。再次装入样品池。当读取最初10个流分的读数时，可借助重力洗脱，每5mL洗脱液更换一次量筒。

    香豆素，乙基香兰素和香兰素依次洗脱。在一个理想的色谱柱中，香豆素在第6—7流分中开始洗脱，在第8—9流分中，达到最大的洗脱量，在第10流分中大为衰减。较早的洗脱液不能使化合物分离;以后的洗脱过程可取更多的流分和时间，但回收率良好。洗脱速度慢一些并不要紧。乙基香兰素约在第11—18流分中、香兰素约在19—30流分中洗脱。

    如果色谱柱是满意的，则再收集25份流分 (共35份)或直到香兰素完全被洗脱为止。按上述操作测定每个流分在270nm和325nm波长处的吸光度A。 如香豆素在第5流分或更早的流分中就开始洗脱，则该柱应弃去。可在硅酸中用少量的水另外制备一根柱，再行校准。如果香豆素在第9—10流分中不被洗脱，则可在硅酸中加较多的水另再制备新柱。

    用校准过的色谱柱进行测试。

2.4样品溶液的制备

    如果各化合物的浓度都不大于0.4g / l00mL，移取样液25mL，放入250mL离心瓶。若化合物浓度大于0.4g / l00mL，则用水将样品液25mL按表1中规定稀释至规定的容积，用25mL溶液。加入水75mL，H₂S0₄ (1+4) 20mL和CHCl₃ 50mL。用橡胶塞塞住，充分振荡3分钟。以1500 r/min转速离心15min。如有乳化现象，用细玻璃棒使其破乳，再行离心。将内容物通过大孔短颈漏斗缓慢地滤入250mL分液漏斗。用玻棒破乳，将CHCl₃层放入100mL容量瓶，水相则通倒回瓶内。

    用CHCl₃，l5mL冲洗分液漏斗，通过漏斗放入瓶内，用充分振动，使各相混合以重复萃取。在初次萃取中，不要剧烈振荡。离心分离，将CHCl₃ 放入100mL容量瓶。再用CHCl₃重复萃取，每次用l5mL，直至容量瓶中的CHCl₃溶液到达刻度。移此溶液2mL，置入25mL容量瓶，用异辛烷稀释至刻度，混合。

2.5鉴定

    移取样品液2 mL (若溶液中化合物浓度小于3.2g / l00ml，则取1ml)放入已制备好的色谱柱上，不要搅动，任样液沿着柱的一侧流下。用约10.4cm Hg的空气压力将溶液压入柱中，l0 mL量筒中收集洗脱液移取溶剂 (c) 1 mL，沿着同一侧流下，并将其驱入柱内，再用溶剂重复洗脱2次，每次1mL。按校准时操作和条件将溶剂注入柱内并洗脱化合物。收集比校准时多3份的洗脱液。按校准时的操作，在270 nm和325 nm波长处测定全部流份的吸光度A。

    将各流分中化合物的吸收峰位置与校准色谱柱时所测得的位置相比较。香豆素在325nm处的吸光度比270 nm处吸光度大1/3 稍多些，这一现象也可用来鉴定香豆素。香兰素和乙基香兰素在325 nm处的吸光度则甚小。如果需要，可测定每种化合物的一个高吸光度流分的紫外光谱以进行鉴定。并与在同一仪器上与提供的光谱相比较。表2列出了各化合物的近似的最大吸收波长和最小吸收波长。表中波长后的括弧内，列出了给定波长下的吸光度A和最高的最大吸收的近似比值，比值为1.00时表示是最高的最大吸收。

2.6测定

    将含有香豆素的所有流分在270 nm波长处的A相加，并计算原样品中的香豆素浓度。

C = F × ∑A / a

式中 : ∑A = 含香豆素的备流分在270 nm处的吸光度A之和；a = 香豆素在270 nm处的吸光度; C=原样品的浓度，以g / l00mL表示; F = 稀释因子 ( 见表1 ) 。

    用类似的方法计算乙基香兰素和香兰素的浓度。

    如果用不含这些化合物的流分测得了负的吸光度A，则含有这些化合物的流分的A值应进行校正。

表1  赋香物的稀释程度和稀释因子

表2 香豆素、乙基兰素和香兰素的吸光度特性

3.来源

AOAC 官方方法955.31 (17版)